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MLPA (Multiplex Ligation dependent Probe Amplification) es un método basado en PCR multiplex utilizado para detectar alteraciones en el número de copias en regiones concretas y previamente conocidas del genoma que están asociadas a una condición genética concreta.
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MS-MLPA es una adaptación técnica del MLPA para la detección de alteraciones de la metilación del DNA asociados a enfermedades genéticas.
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Es el método más fiable y coste-eficaz para detectar deleciones, duplicaciones y variaciones del número de copias (CNV) específicas y previamente conocidas. El diseño y validación de las sondas utilizadas permiten reducir la probabilidad de resultados falsos positivos o negativos.
Resumen del MLPA
MLPA es una técnica que se puede utilizar en cualquier etapa de la vida y requiere una orientación clínica de la condición genética a estudiar. El MLPA está indicado cuando:
- Se sospecha de una enfermedad genética que podría estar causada por una deleción o duplicación en un gen o región genómica concreta
- Se dispone de estudios genéticos precios que son negativos o que solo identifican una variante en un gen asociado a una condición con herencia autosómica recesiva
MLPA se utiliza para el diagnóstico de enfermedades asociadas a:
- Deleciones o duplicaciones de exones, genes o regiones genómicas específicas
- Alteraciones de impronta en regiones genómicas conocidas
- Disomía Uniparental (UPD) de determinados cromosomas
- Pequeños reordenamienos o deleciones intragénicos
- Pequeñas deleciones y reordenamientos asociados a exones, genes o regiones genómicas específicas
- Síndromes de microdeleción
- Enfermedades causadas por alteraciones del patrón de metilación (MS-MLPA)
- Disomía Uniparental específica
- Análisis de deleciones y duplicaciones de la Distrofia Muscular de Duchenne/Becker (DMD/DMB)
- Análisis de deleciones y duplicaciones de la Esclerosis Tuberosa (TSC1/TSC2)
- Análisis de deleciones y duplicaciones de la Hiperplasia Adrenal Congenita (CYP21A2 21-0H)
- Análisis de deleciones y duplicaciones de la Enfermedad de Charcot Marie Tooth tipo 1A (PMP22)
- Análisis de deleciones y duplicaciones de la Atrofia Muscular Espinal (SMN1/SMN2)
- Análisis de deleciones y duplicaciones del Síndrome de DiGeorge (microdeleción 22q11)
- Análisis de deleciones, duplicaciones y metilación de los Síndromes de Prader-Willi yAngelman
- Análisis de deleciones y duplicaciones de la Incontinentia Pigmenti (IKBKG)
- Análisis de deleciones y duplicaciones de genes específicos
- Deleción/duplicación para neurofibromatosis de tipo 1 (NF1)
- Deleción/duplicación para neurofibromatosis de tipo 2 (NF2)
- Análisis de deleción/duplicación para neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro 2B (PLA2G6)
- Análisis de deleción/duplicación para degeneración asociada a pantotenato quinasa (PANK2)
- Deleción/duplicación para distrofia muscular de Duchenne (DMD)
- Análisis de deleción/duplicación de PMP22
- Deleción/duplicación para atrofia muscular espinal (SMN1/SMN2)
- Análisis de deleción/duplicación para síndrome de DiGeorge
- Deleción/duplicación del gen de la fibrosis quística (CFTR)
- Deleción/duplicación para síndrome de Prader-Willi/Angelman
- Análisis de deleción/duplicación ad hoc
Resultados e informes
Hay dos resultados posibles que pueden obtenerse con un test de MLPA:
- Presencia de una deleción, duplicación o alteraciones de metilación
La presencia de una deleción, duplicación o alteración de metilación de un gen o región indica que el resultado es compatible con el diagnóstico de la enfermedad o condición clínica estudiada.
Este resultado permite proporcionar asesoramiento genético y orientación sobre el manejo clínico de la enfermedad, pronóstico, la aplicación de medidas preventivas o terapéuticas y posibles implicaciones reproductivas o para otros miembros de la familia.
- Ausencia de una deleción, duplicación o alteraciones de metilación
La ausencia de una deleción, duplicación o alteración de la metilación indica que no se ha identificado la causa molecular de la enfermedad o condición. Este resultado no confirma ni descarta la indicación clínica de la prueba y no garantiza que el paciente pueda tener cualquier otro trastorno genético. Por esta razón, este resultado no elimina el riesgo de descendencia futura. En el caso de que se conozca la presencia de una alteración genética previa, un resultado negativo sí que descarta la presencia de esa variante genética en el paciente. Un resultado negativo puede explicarse por varias causas, como, por ejemplo, limitaciones en el conocimiento genético actual o derivadas de la metodología utilizada.
Requisitos de muestras
En los casos prenatales:
- Es altamente recomendable el contacto previo con el laboratorio y la planificación de los tiempos para evitar posibles incidencias con los plazos prenatales
- Se requiere muestra de sangre materna junto con las correspondientes muestras prenatales obtenidas mediante líquido amniótico, biopsia corial o restos fetales con el objetivo de descartar una posible contaminación de la muestra fetal con muestra materna
- Otras muestras familiares pueden ser solicitadas como controles positivos.
- Todos los casos prenatales son procesado con la máxima prioridad
Se requiere un adecuado etiquetado de los tubos con la información necesaria del paciente que permita su identificación inequívoca. Un etiquetado incorrecto puede implicar un rechazo de la muestra. La información mínima requerida para identificar y aceptar una muestra es: nombre completo del paciente, fecha de nacimiento, sexo y número de registro médico.
El formulario solicitud y el correspondiente consentimiento informado deben estar debidamente cumplimentados y firmados por el paciente y médico prescriptor.
Limitaciones
El MLPA no permite detectar
- Reordenamientos cromosómicos equilibrados
- Deleciones y duplicaciones teloméricas
- Deleciones y duplicaciones que no estén incluidas en el diseño de las sondas de MLPA utilizadas
- Alteraciones de la secuencia de ADN como mutaciones puntuales, pequeñas deleciones e inserciones
- Expansiones o mutaciones en el ADN mitocondrial
La sensibilidad analítica y la especificidad del método MLPA son del 99%.
Pueden producirse falsos positivos o negativos debido a variantes raras de secuencia en las regiones detectadas por las sondas MLPA. Además, mutaciones puntuales o polimorfismos en esas secuencias pueden generar una reducción en el área relativa del pico. Por este motivo, las deleciones de un solo exón detectadas por MLPA siempre deben confirmarse mediante otros métodos como la PCR múltiple o la secuenciación.